UV-Vis spektroskoopia ja Beer-Lamberti seadus

Kui valgus läbib proovi, mis sisaldab kasutatavatel lainepikkustel neelavat ainet, neeldub osa sellest valgusest ja kiir väljub sisenenust nõrgemana. UV-Vis spektroskoopia mõõdab seda neeldumist lainepikkuse funktsioonina, ja kuna molekulid neelavad kõige tugevamalt lainepikkustel, mis vastavad nende elektroolekute vaheliste energialõhede suurusele, toimib tekkinud neeldumisspekter sõrmejäljena, mis identifitseerib neelava osalise ja kvantitatiivselt näitab, kui palju seda kohal on.

Beer-Lamberti seadus asetab selle kvantitatiivse seose täpsele alusele: neeldumine A (defineeritud kui langeva ja läbitud valguse intensiivsuse suhte logaritm) võrdub ε·c·l-ga, kus ε on moolne neeldumisvõime (neelava osalise ja kasutatava lainepikkuse jaoks spetsiifiline konstant), c on neelava osalise kontsentratsioon ja l on teepikkus, mille valgus läbib proovis. Sellesse ühte võrrandisse on pakitud kaks võrdelisust ja mõlemad on praktilise mõõtmise jaoks olulised. Esiteks on neeldumine fikseeritud teepikkuse juures otseselt võrdeline kontsentratsiooniga — see on sisuliselt kogu kvantitatiivse UV-Vis analüüsi alus, kuna teadaoleva kontsentratsiooniga standardlahuste seeria neeldumise mõõtmine ja neeldumise joonestamine kontsentratsiooni suhtes tekitab sirge kalibreerimisjoone, millest saab tundmatu proovi kontsentratsiooni otse välja lugeda, kord kui selle neeldumine on mõõdetud. Teiseks on neeldumine fikseeritud kontsentratsiooni juures otseselt võrdeline teepikkusega, mis on põhjus, miks spektrofotomeetris proove hoidvatel küvettidel on täpselt fikseeritud, teadaolev teepikkus (väga sageli 1 cm), et teepikkust saaks käsitleda konstandina ja kontsentratsiooni saaks puhtalt välja võtta üksikust neeldumisnäidust.

Beer-Lamberti seadus kehtib hästi madalatel kuni mõõdukatel kontsentratsioonidel, kuid tegelikud mõõtmised kalduvad kõrgel kontsentratsioonil rangest lineaarsusest kõrvale — tihedalt pakitud neelavad molekulid hakkavad üksteisega suhtlema ja instrumentaalsed efektid nagu hajavalgus muutuvad proportsionaalselt olulisemaks, mõlemad kõverdavad neeldumise-kontsentratsiooni seost eemale ideaalsest sirgest. Usaldusväärne kvantitatiivne analüüs nõuab seetõttu proovide kontsentratsioonide hoidmist vahemikus, kus seaduse lineaarne lähendus tõeliselt kehtib, tavaliselt kinnitatuna, kontrollides, et kalibreerimiskõver jääb sirgeks huvipakkuvate kontsentratsioonide ulatuses.